Новый метод выделения ДНК из парафиновых блоков и удаление артефактов секвенирования

Интерлабсервис

Фиксация тканей формалином и длительное хранение образцов (парафиновые блоки, FFPE) при неблагоприятных условиях способствуют сильным повреждениям ДНК. Результатом этого может быть появление артефактов при секвенировании данных образцов. Транзиции цитозин-тимин составляют большинство таких артефактов (1, 2). Хотя точный механизм этого процесса неизвестен, одним из объяснений является тот факт, что дезаминирование цитозина приводит к формированию в этом положении урацила (Рис. 1). 

При секвенировании формируется пара с аденином (3) и это модифицированное основание читается как замена C>T. Если нить-специфическая информация ДНК не сохраняется во время создания библиотеки и комплементарная нить ДНК не может быть секвенирована, то артефакт может проявиться в виде замен C>T или G>A. Удаление таких артефактов в образцах особенно важно при поиске соматических мутаций в онкогенах, так как они в противном случае могут определяться как ложноположительные мутации.

 

Рисунок 1. Дезаминирование цитозина приводит к спариванию с аденином. В парафиновых блоках цитозин может дезаминироваться, что приводит к образованию урацила и образованию пары с аденином. В реакции секвенирования это будет проявляться как транзиции C>T или G>A.

Удаление ложноположительных вариантов

Для проверки работы нового набора было проведено сравнительное исследование. Образцы ДНК были выделены параллельно с использованием стандартного набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit и нового набора GeneRead DNA FFPE Kit. Выявление соматических мутаций было произведено с использованием технологии секвенирования нового поколения и панели для таргетного обогащения генов GeneRead DNAseq Comprehensive Cancer Panel (Рис. 2). 

Частота обнаруженных мутаций показана в двух последних столбцах. 4 мутации из 19, которые были обнаружены с использованием стандартного набора, не подтвердились с применением новой технологии GeneRead DNA FFPE Kit. Это были мутации с самой низкой частотой встречаемости и все из них являлись заменами C>T и G>A. Таким образом, эти замены являются артефактами фиксации образцов формалином и длительного хранения. Все другие мутации были найдены в обоих образцах с очень близкими значениями частот встречаемости, что указывает на то, что новый набор специфически удаляет артефактные транзиции, оставляя истинные мутации без изменений.

 

Рисунок 2. Анализ соматических мутаций материала карциномы печени, фиксированном в парафиновом блоке. Данный образец хранился в течение 15 лет.

Новая технология выделения и очистки ДНК из FFPE образцов

Компания QIAGEN существенно модифицировала нынешнюю технологию выделения и очистки ДНК из FFPE образцов. Новая технология была разработана для того, чтобы избавиться от артефактов секвенирования, возникших в результате фиксации образцов формалином и хранения, а также с целью оптимизации выхода очищенной ДНК из небольших количеств исходного материала.

Уникальные характеристики нового набора реагентов GeneRead DNA FFPE Kit:

• Ферментативное удаление артефактов секвенирования, являющихся результатом фиксации и хранения образцов;
• Высокий выход очищенной ДНК из малого количества клинического материала;
• Применение эффективной и нетоксичной депарафинизации;
• Возможность автоматизации процесса выделения ДНК с использованием станции QIAcube.

Рисунок 3. Ферментативное удаление артефактов секвенирования с использованием урацил-ДНК-гликозилазы.

Набор реагентов GeneRead DNA FFPE Kit содержит в своем составе уникальный фермент урацил-ДНК-гликозилазу, который специфически отщепляет несвойственные последовательностям ДНК нуклеотидные основания урацила (Рис. 3). Готовый набор оптимизирует условия для точной и эффективной работы фермента с целью удаления артефактов секвенирования. Обнаружение низкочастотных мутаций может быть очень важным, например, в анализе образцов при проведении онкологических исследований. Поэтому важно провести четкое различие между истинными и ложноположительными мутациями. Удаление артефактов особенно актуально, когда секвенируются малые количества исходного материала, в котором относительная частота таких ложноположительных мутаций может быть увеличена.

Некоторые из обнаруженных в ходе анализа замен C>T или G>A могут не иметь клинической значимости. Однако из-за артефактов секвенирования большая часть этих мутаций может быть аннотирована с использованием баз данных, в частности dbSNP и COSMIC. По результатам такого анализа могут быть сделаны неверные выводы всего исследования.

Таким образом, новая технология GeneRead DNA FFPE Kit способна максимизировать выход очищенной ДНК из парафиновых блоков и, в тоже время, эффективно удалить артефакты секвенирования C> T и G>A.